تحضير الشرائح للفحص المجهري

يعتمد علم التشريح المرضي على غيره من العلوم كعلم النسج و علم التشريح ( علم النسج بشكل أكبر ) و يعتمد على فتح جثث الحيوانات النافقة للتعرف على التغيرات المرضية أثناء الحياة و بعد الموت و تفريقها عن بعضها البعض , و كذلك التعرف على الأعضاء المصابة و أخذ العينات اللازمة و حفظها و إرسالها إلى المخبر .
الآفة : هي التبدلات والتغيرات في عضو ما .
- قد تلاحظ الآفة بالعين المجردة فتدعى الآفة العينية و قد لا تلاحظ بالعين المجردة فتدعى بالآفة المجهرية .
-الهدف من أخذ العينات دراسة الإصابة المرضية و التشخيص السليم للإصابة .
-أفضل العينات هي التي تؤخذ من نسيج الحيوانات المذبوحة اضطرارياً أو النافقة (بعد النفوق مباشرة ) و ذلك لأنها لم تتعرض للتغيرات الرمية التي حصلت بعد الموت و كذلك من الممكن أخذ العينات عند إجراء العمليات الجراحية .
الخزعة : عبارة عن قطعة نسيجية صغيرة الحجم تؤخذ مباشرة من الأعضاء المتغيرة المراد فحصها بعد موت الحيوان أو أثناء إجراء العملية الجراحية .
الغرض من أخذ الخزعة : الهدف من أخذ الخزعة الحصول على شرائح نسيجية يمكن فحصها مجهرياً و تحديد نوع الآفة المرضية بدقة للوصول إلى تشخيص الحالة المرضية
شروط أخذ الخزعة :
1- شمولية الخزعة : أن تشمل على أجراء سليمة و أخرى مصابة و ذلك بهدف مقارنة التغيرات النسيجية مع النسج السليمة .
2- أن تؤخذ الخزعة أو العينة بأسرع ما يمكن بعد الموت (خلال30 دقيقة ) و وضعها مباشرة في السائل المثبت و ذلك قبل بدء ظهور الرمية و عمليات التفسخ و التحلل الذاتي و التي تعيق معاينة التغيرات المرضية و أحياناً تجعل التشخيص مستحيلاً .
3- حجم الخزعة : يجب أن تكون الخزعة صغيرة (1 – 2) سم كي يسهل تثبيتها .
4- طريقة قطع الخزعة : يجب استعمال سكين حاد كي لا يحدث تهتك في النسيج أثناء القطع كما يجب أن تكون الخزعة نظيفة كما لا يجب غسلها من الأوساخ و الدماء و القيح لأنها هامة للتشخيص .
5- ترقيم الخزعة : يجب ترقيم الخزعات بأرقام تدل على مصدر و هوية الخزعة .
6- تنظيم تقرير مفصل عن الخزعة و إرفاقه بها .
7- عند الشك بحالة مرضية معينة فإننا لابد أن نعرف من أين نأخذ العينة و أن نأخذها من المكان المناسب بسرعة :
1)- عند الشك بالليكوزس تؤخذ العقد اللمفاوية و الأعضاء كالطحال و القلب و الكبد و الكلية .
2)- الأورام يؤخذ الجزء المصاب من العضو .
3)- السل و الرعام يؤخذ الجزء المصاب من العضو و العقد اللمفاوية الناحية .
4)- نظير السل تؤخذ الأمعاء المصابة ( اللفائفي ) و العقد اللمفاوية الناحية .
5)- الشك في السالمونيلا يؤخذ الكبد .
6)- ليبتوسبيروز خلال 30 دقيقة بعد النفوق من الكلية و الكبد .
7)- فقر الدم المعدي عند الخيول (الكبد – القلب – الطحال – الرئة – الكلية ) .
- المايكو بلازما الجزء المصاب من العضو .
9)- الأمراض الفطرية و الطفيلية يؤخذ الجزء المصاب من العضو .
• بعد عملية أخذ العينة نقوم بتثبيتها .


تثبيت العينات المأخوذة :
الهدف من العملية : الحفاظ على التغيرات المرضية الحاصلة و توقيف عمليات التفسخ لأن وظيفة المثبت منع التفسخ و حفظ الخزعة لمدة طويلة .
شروط تثبيت العينة :
ليتم تثبيت العينة لابد من توفر عدة شروط :
1- أن تكون كمية السائل المثبت أكبر من حجم العينة ب(15 –20) مرة .
2- عند وضع الخزعة بسائل التثبيت يجب أن لا تلتصق بجدار أو قعر الإناء لأن السائل المثبت لا يمكن أن يدخل في الخزعة من الجهة الملتصقة بجدار أو قعر الإناء لذلك يجب وضع قطن طبي حول الخزعات الكبيرة التي نضمن وصول السائل المثبت إلى الخزعة من جميع الجهات .
3- عدم غسل الأعضاء و الأجزاء المأخوذة بالماء قبل التثبيت ما عدا الأغشية المخاطية في الأنبوب الهضمي حيث تزال محتويات الأمعاء بالماء قبل التثبيت .
4- يجب أن يكون الإناء زجاجيا ًنظيفا ًو أن تكون الأدوات نظيفة .
5- تغيير السائل إذا كان عكراً أو انصبغ بلون الدم .
6- يجب أن تكون الخزعات رقيقة كي يدخلها سائل التثبيت بسرعة و سهولة .
7- يجب شد الخزعات الرقيقة كقطع الأمعاء على ألواح خشبية كي لا تنطوي على بعضها البعض .
8- يتم التثبيت بدرجة حرارة الغرفة ( 16- 20 ) م و يتم بصورة أسرع بدرجة حرارة ( 37- 40) م .
• السوائل المثبتة عديدة و تقسم حسب تركيبها إلى :
أ‌- بسيطة : تتألف من مادة واحدة مثل الفورمالين .
ب‌- مـعقدة : تتألف من أكثر من مادة مثل سائل كارنوي و حمض البكرين .
• الفورمالين : يستخدم بصورة واسعة و يؤخذ التجاري منه بنسبة 1 فورمالين – 9 ماء و مدة التثبيت /24- 48/ ساعة و تنخفض بدرجة حرارة 36- 38 م إلى /15- 18/ ساعة .
• الكحول : و يستعمل عادة الكحول المطلق و عالي التركيز (96 – 100) % و إذا بقيت الخزعة فترة طويلة في الكحول فإنها تتخرب و لا تصلح للتلوين .
• كلوريد الزئبق : و هو مادة سامة تحقق تثبيتاً سريعاً .
• حمض البكرين : مادة سامة تستعمل نادرا ًو هو خليط مؤلف من
(30) جزء محلول حمض البكرين المائي المشبع .
(10) أجزاء فورمول .
(2) جزء حمض خل ثلجي .
• سائل كانوري : يتألف من
(6) أجزاء كحول
(3)أجزاء كلوروفورم
(1) جزء حمض خل ثلجي
و يتم التثبيت خلال 3 –4 ساعات
- لأجل دراسة العينات بالمجهر الإلكتروني يجري تثبيت العينات بمثبتات خاصة مثل غلوتاز ألدهيد مع محلول بوفر فوسفات ثم تمرر العينة في رابع أكسيد الكبريت أو الأوسيما Buffer phosphat tetra oxid of sulphat
- السوائل المثبتة لها دور في عمل التغيرات حيث تؤدي إلى تخثر البروتينيات و تغير لون العضو و قساوته لذلك نعتبر أن أفضل السوائل المثبتة هي التي تحافظ على أو تعمل أقل قدر ممكن من التغيرات في النسيج .


طريقة إزالة الكلس من الخزعات العظمية :
هناك أنواع من النسج الصلبة مثل العظام و التي يتطلب تليينها لفحصها و تقطيعها و بالتالي نحتاج لتثبيتها من أجل تقطيعها بالميكراتوم لذلك نقوم بامرارها بجميع مراحل التثبيت مع وضعها بالإضافة لذلك في حمض كلور الماء للإزالة المواد الكلسية لعدة أيام ثم نقوم بعملية الإدماج و تقطيعها كأي نسيج عادي .
هناك طرق أخرى للتثبيت بالتجميد عن طريق أول أكسيد الكربون و ذلك لدراسة الشحوم في العينة الطازجة .
بعد عملية التثبيت نقوم بعملية الإدماج عن طريق أخذ العينة ثم :
1- نغسلها بالماء الجاري من المحلول المثبت ( تحت صنبور من الماء ) و ذلك لمدة قد
تصل إلى 24 ساعة .
2- إذا كانت مثبتة بالكحول لا داعي لغسلها .
3- التجفيف بورق النشاف دون الضغط على العينة ثم ننقلها إلى الكحول لإزالة الماء حيث تمرر العينة في تراكيز مختلفة من الكحول هي أولاً في كحول بتركيز 70 % ثم بتركيز 80 % ثم 90 % ثم كحول مطلق .
تبقى الخزعة في الكحول ذي التركيز المنخفض لمدة 3 –4 ساعات و في الكحول عالي التركيز لمدة 12 –24 ساعة .
إن هذه الفترة الزمنية تتعلق بحجم الخزعة فإن كانت أصغر من 1 سم2 فإنها تبقى لفترة أقصر من الفترة المذكورة و إن كانت أكبر فإنها تبقى لفترة أطول .
ملاحظة : نحصل على الكحول المطلق عن طريق إضافة الكحول 96 % إلى كبريتات النحاس فتمتص الماء الموجود في الكحول و يتحول إلى كحول مطلق .
ملاحظة : يجب أن لا تطول فترة وضع العينة في الكحول 96 لفترة طويلة حتى لا تجف و بالتالي صعوبة تقطيعها .
4 - بعد الانتهاء من وضع العينة و تمريرها في الكحول نضعها إما في الزايلول أو الكلوروفورم مرتين لمدة 1 – 3 ساعات في كل مرة أو كل وعاء .
5 - ننقل العينة إلى محلول آخر يتكون من الكلوروفورم أو الزايلول مع البرافين ( الهدف من مزج المادتين إعطاء إمكانية العضو لتشرب البرافين ليسهل نقله إلى الشريحة و كذلك التقطيع ) و ذلك لمدة 1-3 ساعات ثم تنقل إلى وعاء يحوي كلوروفورم و بارافين لمدة 1-3 ساعات بدرجة حرارة 37 م . بعد ذلك ننقل العينة إلى محلول آخر هو البرافين الذائب (سائل ) بدرجة حرارة 57 م و يوضع في الترموستات لمدة 3 ساعات ثم ننقله إلى وعاء آخر من برافين سائل حتى درجة حرارة 57 م لمدة 3 –24 ساعة .
6- ننقلها بعد ذلك إلى مكعبات (نثبتها على مكعبات خشبية) و نقطعها إلى أجزاء صغيرة بواسطة الميكراتوم .
- يتألف الميكراتوم من 3 أجزاء رئيسية :
1) جزء لتثبيت الخزعة
2) جزء لتثبيت سكين القطع
3) جزء للتحكم في سماكة الشريحة
التلوين ( تلوين الشرائح ): بعد قطع الشرائح نقوم بتلوينها
الهدف من التلوين تسهيل رؤية النسج لأن المادة الملونة تعطي قرائن انكسار مختلفة مما يسهل تمييز الخلايا عن بعضها .
هناك عدة أصبغة تستخدم للتلوين :
أصبغة النواة
لون أزرق للنواة
الهيماتوكسلين
أزرق المثلين
التلودين الأزرق


لون أحمر للنواة
الثيودين
الكارمين

أصبغة الهيولى الأيوزين لون رمادي
فوكسين حمضي لون أحمر
حمض البكريك يلون الألياف بالأصفر
سودان 3 , 4

الإدماج الخطوات العملية :
1- التثبيت لمدة 24 ساعة بالفورمالين .
2- غسيل بالماء الجاري 6 ساعات .
3- كحول 70 % 2 ساعة .
4- كحول 80 % 2 ساعة .
5- كحول 95 % 2 ساعة .
6- كحول 95 % 2 ساعة .
7- كحول 100 % 2 ساعة .
8- كحول 100 % 2 ساعة .
9- كحول 100 % 2 ساعة .
10- كلورفورم 2 ساعة .
11- كلورفورم 2 ساعة .
12- بارافين 3 ساعات .
13- بارافين 3 ساعات .
14- الصب ضمن القوالب .




الصباغة التلوين عملياً :
1 - زايول 10 دقائق
2 - زايول 5 دقائق
3 - كحول 100 % 5 دقائق
4 - كحول 100 % 5 دقائق
5 - كحول 95 % 5 دقائق
6 - كحول 80 % 5 دقائق
7 - كحول 70 % 5 دقائق
8 - ماء مقطر % 5 دقائق
9 - صبغة الهيماتوكسين 15 – 30 دقيقة
10- غسيل بالماء الجاري 10 –15 دقيقة
11- غسيل بالماء المقطر نغمس فقط
12- حمض كلور الماء 1 % نغمس فقط
13- ماء المقطر نغمس فقط
14- صبغة الأيوزين 10-15 دقيقة
15- غسيل بالماء الجاري 10 –15 دقيقة
16- غسيل بالماء الجاري 10 –15 دقيقة
17- كحول من 70 – 80 –95 –100 نغمس فقط
18- زايول على مرحلتين الأولى نغمس فقط و الثانية حتى وضع الساترة